Descripció del projecte
La ataxia de Friedreich (FRDA; MIM #229300) es una enfermedad neurodegenerativa progresiva rara, que presenta una herencia autosómica recesiva y una prevalencia de 1 en 25.000 personas en el sureste de Europa. Sus primeros signos suelen aparecer durante la infancia o adolescencia temprana, como la pérdida de propiocepción sensitiva en el sistema nervioso periférico. Esta neurodegeneración progresiva puede presentarse junto con alteraciones de la función cardiaca debidas a una miocardiopatía hipertrófica que se encuentra presente en el 40,3% de los casos, intolerancia a los carbohidratos en el 20%, y sordera y ceguera en el 36,8%.La FRDA está causada en el 96-98% de los casos por una mutación expansiva del triplete inestable GAA en el primer intrón del gen que codifica para la proteína mitocondrial frataxina (FXN), que causa el silenciamiento parcial de la transcripción del gen reduciendo la expresión de la proteína y los niveles de ésta. La proteína FXN ha sido implicada en la bioenergética de la mitocondria, metabolismo del hierro, transporte y almacenaje, y en la síntesis de grupos hemo. En los últimos años se han generado múltiples modelos de ratones con deficiencia de FXN que mimetizan la enfermedad, incluyendo un modelo knock-in knockout (KIKO); ratones transgénicos, YG8R e YG22R, que contienen el gen FXN humano completo, con la mutación GAA patogénica, incluido en un cromosoma artificial de levadura; ratones knockout condicionales específicos tanto para tejido cardíaco como para neuronal; y un nuevo modelo knockout condicional (Pvalb FXN-CKo) obtenido recientemente que imita la neuropatofisiología de la enfermedad de manera más rápida y severa que modelos previos.
El objetivo general de este proyecto es el desarrollo de una terapia génica mediante un vector viral que sea trasladable a la práctica clínica. Para ello se cumplirán 3 objetivos específicos:
1. Evaluación de los signos clínicos en el modelo agudo de la enfermedad (Pvalb FXN-CKo), un modelo de ratón pobremente caracterizado por su novedad;
2. La evaluación de diferentes vectores virales adenoasociados de terapia génica generados para el tratamiento de la FRDA en un el modelo agudo de la enfermedad, y
3. La identificación de biomarcadores de utilidad clínica como indicadores potenciales de la severidad de la enfermedad, así como de la eficacia del tratamiento. La evaluación de los signos clínicos de la enfermedad en el modelo elegido se llevará a cabo mediante pruebas de comportamiento que analizan el fenotipo atáxico y la coordinación motora, como el rota-rod acelerado, el notched bar y el estudio de la marcha de los ratones entre otros. Además de estos estudios neurocognitivos, también se realizará una evaluación neuroelectrofisiológica en el mismo modelo. A este modelo condicional, a diferencia de otros modelos murinos generados, se le ha descrito un fenotipo motor y sensitivo muy severo, de aparición temprana, y más similar a la patología. La aparición temprana de los signos de la enfermedad permite una evaluación y obtención de resultados más rápido que con un modelo de afectación tardía. Mientras que, la severidad de su fenotipo neurológico favorece la evaluación preclínica y análisis eficientes de cualquier tratamiento debido a la facilidad de evaluar la eficacia de este. Esto permite realizar el segundo objetivo del proyecto, evaluando la recuperación del fenotipo motor-sensitivo y la neuropatología del ratón, así como la expresión de FXN exógena recombinante en los diferentes tejidos del ratón mediante Western Blot e inmunohistoquímica, tras el tratamiento con dos vectores adenoasociados mejorados. Estos vectores han sido mejorados a partir de un vector que demostró ser exitoso en una prueba de concepto realizada en ratones transgénicos YG8R.
Para cumplir los requerimientos de las agencias reguladoras europea y estadounidense se necesita seleccionar el candidato clínico final que se llevará posteriormente a la fase clínica Ib/IIa en 20-30 pacientes con FRDA para evaluar la eficacia y seguridad del tratamiento de la enfermedad mediante terapia génica. Por último, se identificarán biomarcadores epigenómicos y moleculares, sanguíneos y de líquido cefalorraquídeo, que sean indicadores potenciales de la severidad de la enfermedad y de la eficacia del tratamiento. En cuanto a la identificación de biomarcadores epigenómicos, se analizarán los niveles de metilación asociados a la longitud de la expansión mediante secuenciación dirigida por nanoporos de fragmentos que abarcan tanto la región repetitiva, como sus regiones flanqueantes, donde ya se han descrito regiones hiper e hipometiladas relacionadas con la expansión GAA patológica. También se identificarán biomarcadores transcriptómicos asociados a FRDA mediante RNAseq de ARN extraído de muestras de sangre de pacientes, portadores y no portadores de la enfermedad.
Esto permitirá identificar mARN, miARN y lncARN cuya expresión se ve afectada por el silenciamiento de la expresión de FXN, que podrían correlacionarse con la progresión de la enfermedad y las intervenciones farmacológicas, pudiendo contribuir al diseño de nuevas estrategias terapéuticas y mejorar las decisiones clínicas. Esto podría asociarse con alteraciones en el proteoma, estudiando el proteoma de plasma tanto en individuos asintomáticos portadores de la mutación como en pacientes. Además, se plantea la obtención de perfiles lipídicos y metabolómicos en plasma y orina de pacientes de FRDA. Para el análisis de estos metabolitos se utilizarán técnicas como la cromatografía líquida y de gases combinada con espectrometría de masas, y 1H-NMR. También se propone el análisis del estado de acetilación de proteínas mitocondriales; el estudio de la actividad de la aconitasa mitocondrial; el análisis de biomarcadores de estrés oxidativo; y, el análisis del metabolismo mitocondrial en pacientes de FRDA. Una vez identificados los biomarcadores de utilidad, estos podrán ser evaluados en el modelo de ratón para el seguimiento del tratamiento en el modelo preclínico.
En resumen, en este proyecto se seleccionará un vector de terapia génica como candidato clínico para tratar el paciente con FRDA, además de identificar biomarcadores de utilidad clínica para analizar la eficacia del tratamiento, previo a la observación de cambios fenotípicos en estados iniciales de la enfermedad.
